轉(zhuǎn)錄因子EGR2對肺泡巨噬細(xì)胞AM組織修復(fù)中的組織特異性印記*

肺泡巨噬細(xì)胞是健康肺中分布豐富的巨噬細(xì)胞，它們在體內(nèi)平衡和針對空氣傳播病原體的免疫監(jiān)視中發(fā)揮關(guān)鍵作用。肺泡巨噬細(xì)胞的組織特異性分化和存活依賴于生態(tài)位衍生因子，如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF) 和轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)。然而，調(diào)節(jié)肺泡巨噬細(xì)胞特性和功能的下游分子通路的性質(zhì)及其對損傷的反應(yīng)仍然知之甚少。在這里，我們確定轉(zhuǎn)錄因子 EGR2 是肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)化上保守的特征，并表明細(xì)胞內(nèi)在 EGR2 對于肺泡巨噬細(xì)胞的組織特異性身份是*的。從機(jī)制上講，我們表明 EGR2 由 TGF-β 和 GM-CSF 以 PPAR-γ 依賴性方式驅(qū)動，以控制肺泡巨噬細(xì)胞分化。在功能上，EGR2 對于調(diào)節(jié)氣道中的脂質(zhì)是可有可無的，但對于有效處理呼吸道病原體至關(guān)重要肺炎鏈球菌。最后，我們表明 EGR2 是無菌、博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷后肺泡生態(tài)位重新增殖所必需的，并證明 EGR2 依賴性、單核細(xì)胞衍生的肺泡巨噬細(xì)胞對于損傷后的有效組織修復(fù)至關(guān)重要。總的來說，我們證明 EGR2 是控制肺泡巨噬細(xì)胞在健康和疾病中的身份和功能的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)*的組成部分。

結(jié)論

鑒于巨噬細(xì)胞在組織穩(wěn)態(tài)、炎癥和組織修復(fù)以及許多慢性病理中的多方面作用，了解控制巨噬細(xì)胞分化的環(huán)境信號和下游分子途徑是免疫學(xué)領(lǐng)域的一個關(guān)鍵目標(biāo)。在這里，我們將轉(zhuǎn)錄因子 EGR2 鑒定為肺泡巨噬細(xì)胞組織特異性分化的選擇性和*的部分。

我們的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析將 EGR2 鑒定為鼠肺泡巨噬細(xì)胞的一個特征，這一發(fā)現(xiàn)與之前使用大量轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的研究和最近使用類似基于 scRNA-seq 的方法的研究一致。我們發(fā)現(xiàn) EGR2 似乎代表了進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，這也與之前的研究一致。盡管過去 EGR2 與控制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化有關(guān)，但這些研究經(jīng)常得出不一致的結(jié)論。這可能反映了一個事實(shí)，即由于全球Egr2 缺陷小鼠的出生后致死率，大多數(shù)研究 EGR2 在單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞分化中的作用的研究都使用了體外培養(yǎng)系統(tǒng)。通過生成Lyz2 ^Cre。Egr2 ^fl/fl和Fcgr1 ^iCre。Egr2 ^fl/fl小鼠，我們規(guī)避了這種致死性，并證明 EGR2 控制著大部分的肺泡巨噬細(xì)胞特征。這與最近的表觀遺傳分析一致，表明定義肺泡巨噬細(xì)胞的基因中 EGR 基序過多。盡管以前的工作表明 EGR 家族成員之間存在冗余，特別是 EGR1 和 EGR2，但我們發(fā)現(xiàn)Egr1表達(dá)不受 EGR2 缺陷的影響，并且無法挽救肺泡巨噬細(xì)胞分化。

如果簡單地根據(jù)它們的 CD11c ^hi CD11b ^lo譜進(jìn)行評估，那么肺泡巨噬細(xì)胞的絕對數(shù)量在成人Egr2 ^fl/fl和Lyz2 ^Cre之間是相等的。Egr2 ^fl/fl小鼠。這可以解釋為什么最近的一項(xiàng)研究使用Lyz2 ^Cre的獨(dú)立菌株。Egr2 ^fl/fl小鼠得出結(jié)論，EGR2 對巨噬細(xì)胞分化來說是*的?；蛘撸@可能反映出他們的大部分研究都涉及體外生成的、依賴于 CSF1 的巨噬細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)Egr2- 當(dāng)用 CSF-1 在體外培養(yǎng)時，缺陷單核細(xì)胞同樣很好地成熟為巨噬細(xì)胞。然而，在我們手中，CSF-1 導(dǎo)致體外成熟巨噬細(xì)胞中 EGR2 的上調(diào)不佳。取而代之的是，我們確定了GM-CSF作為EGR2表達(dá)，與肺泡巨噬細(xì)胞上的肺泡上皮細(xì)胞來源的GM-CSF的依賴它們的發(fā)展和存活（一致的發(fā)現(xiàn)的有效誘導(dǎo)）。Lyz2 ^Cre 的缺陷。Egr2 ^fl/fl小鼠并沒有反映 GM-CSF 信號分子表達(dá)的一致差異。EGR2 通常被稱為替代巨噬細(xì)胞激活的特征，因?yàn)?IL-4 可以在體外以信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 6 依賴的方式驅(qū)動 EGR2 上調(diào) 。然而，我們排除了 IL-4 在肺泡巨噬細(xì)胞 EGR2 調(diào)節(jié)中的作用。因此，IL-4-IL-4R 軸對于在體內(nèi)誘導(dǎo) EGR2 表達(dá)是足夠的，但不是必需的。TGF-β 還誘導(dǎo) EGR2，我們證實(shí) TGF-βR 信號傳導(dǎo)對于肺泡巨噬細(xì)胞的發(fā)育是*的。GM-CSF和TGF-β是否以及如何協(xié)同促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞分化尚不*清楚；然而，它們都誘導(dǎo) PPAR-γ的表達(dá)，并且Pparg 缺陷的肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)減少的 EGR2，表明 EGR2 位于 PPAR-γ 的下游。在肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)育過程中是否需要初始的 TGF-β 信號來誘導(dǎo) EGR2，或者是否需要持續(xù)的 TGF-βR 信號來維持 EGR2 仍有待確定，并且需要新的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)來允許 TGF-βR 的誘導(dǎo)性缺失。盡管Pparg、Csf2rb或Tgfbr2 的基因消融導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)育和自我維持的缺陷，Egr2缺陷無法復(fù)制這種情況。因此，依賴 EGR2 的程序似乎代表了肺泡巨噬細(xì)胞分化的一個離散部分。與此一致的是，具有Egr2髓細(xì)胞或巨噬細(xì)胞缺失的小鼠沒有發(fā)生自發(fā)性肺泡蛋白沉積癥，這表明 EGR2 對表面活性劑的調(diào)節(jié)是多余的。然而，Egr2缺陷小鼠在控制低劑量肺炎鏈球菌感染的能力方面表現(xiàn)出功能性缺陷。雖然我們不能排除這反映了Egr2殺傷能力差異的可能性-缺陷的肺泡巨噬細(xì)胞、編碼例如活性氧和氮種類的基因不受Egr2缺陷的影響。相反，在缺乏 EGR2 的情況下，編碼關(guān)鍵病原體識別受體和調(diào)理素的基因顯著下調(diào)。這些包括 MARCO 和補(bǔ)體成分 C3，兩者都已被證明對于有效消除肺炎鏈球菌至關(guān)重要。調(diào)理作用是優(yōu)化肺泡巨噬細(xì)胞在健康和疾病中的細(xì)菌清除的關(guān)鍵因素。因此，很明顯，EGR2 依賴性分化為肺泡巨噬細(xì)胞配備了識別和吞噬肺炎球菌的機(jī)制，這可以解釋EGR2突變個體的復(fù)發(fā)性肺炎。在未來的工作中，重要的是要確定這是否會擴(kuò)展到其他呼吸道病原體。此外，鑒于 MARCO 似乎定義了一個離散的表達(dá) CXCL2 的肺泡巨噬細(xì)胞亞群，在真菌感染的情況下具有升高的促炎特征，確定所有肺泡巨噬細(xì)胞消除S的能力是否相同將是有意義的。肺炎或類似的 CXCL2 ⁺ 在這種情況下存在具有優(yōu)異抗菌能力的子集。

肺泡巨噬細(xì)胞的丟失是肺部炎癥或損傷的常見特征。與之前的工作一致，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞補(bǔ)充的主要機(jī)制是通過招募 BM 衍生細(xì)胞，這些細(xì)胞隨著時間的推移成熟為真正的肺泡巨噬細(xì)胞。使用基于Cx3cr1的遺傳命運(yùn)圖譜，我們還表明在損傷的纖維化階段可以在氣道中發(fā)現(xiàn)具有混合表型的CX3CR1 ⁺ MHCII ⁺細(xì)胞，這表明在損傷后積累在肺實(shí)質(zhì)中的單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞可能會補(bǔ)充肺泡巨噬細(xì)胞生態(tài)位。雖然我們不能排除單核細(xì)胞，包括 Ly6C lo單核細(xì)胞，在這個階段進(jìn)入氣道直接產(chǎn)生肺泡巨噬細(xì)胞，RFP ⁺過渡細(xì)胞的表型與實(shí)質(zhì)中引發(fā)的單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞的表型更一致，包括高水平的 MHCII。肺泡巨噬細(xì)胞室的重新增殖依賴于 EGR2，EGR2 的組成性缺失嚴(yán)重削弱了單核細(xì)胞衍生細(xì)胞向肺泡巨噬細(xì)胞壁龕的植入。這與胎兒肝臟來源的單核細(xì)胞發(fā)育的肺泡生態(tài)位的初始群體形成對比，其中Egr2缺乏不影響肺泡巨噬細(xì)胞的發(fā)育。這可能表明發(fā)育不同的單核細(xì)胞對 EGR2 的差異依賴性或發(fā)育過程中存在的補(bǔ)償途徑在再增殖過程中不存在，需要進(jìn)一步的工作來充分理解這一點(diǎn)。

盡管先前的工作表明單核細(xì)胞衍生的肺泡巨噬細(xì)胞是關(guān)鍵的促纖維化細(xì)胞，但纖維化似乎在Egr2 缺陷小鼠中正常發(fā)展，盡管幾乎沒有單核細(xì)胞衍生的肺泡巨噬細(xì)胞。我們的研究結(jié)果與 Misharin等人的研究結(jié)果存在差異的原因。不清楚，但它可以反映所用系統(tǒng)的差異。例如，Misharin 研究利用了肺泡巨噬細(xì)胞對 Caspase-8 的依賴性，使用Lyz2 ^Cre阻止單核細(xì)胞分化為肺泡巨噬細(xì)胞。Casp8 ^fl/fl和Itgax ^Cre。Casp8 ^fl/fl小鼠。然而，Caspase-8 的缺失也會影響間質(zhì)巨噬細(xì)胞在耗盡后重新增殖的能力，這意味著Casp8缺乏對肺巨噬細(xì)胞行為的影響可能比破壞單核細(xì)胞衍生的肺泡巨噬細(xì)胞的分化更廣泛。相比之下，EGR2 表達(dá)僅限于肺泡巨噬細(xì)胞，刪除不影響間質(zhì)巨噬細(xì)胞室的重建。間質(zhì)巨噬細(xì)胞在與成纖維細(xì)胞相鄰的實(shí)質(zhì)中的位置及其產(chǎn)生的成纖維細(xì)胞促分裂原血小板衍生生長因子 aa (PDGF-aa) 表明間質(zhì)巨噬細(xì)胞可能是纖維化過程的關(guān)鍵。消耗間質(zhì)巨噬細(xì)胞Cx3cr1 ^Cre-ERT2。Rosa26 ^LSL-DTA小鼠減少了肺纖維化，盡管正如我們在此展示的，這也將針對注定要成為單核細(xì)胞衍生的肺泡巨噬細(xì)胞的CX3CR1 ⁺細(xì)胞。盡管如此，我們的數(shù)據(jù)顯示了單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞在組織修復(fù)過程中的明確作用，因?yàn)長yz2 ^Cre。Egr2 ^fl/fl小鼠在受傷后未能修復(fù)肺，這一發(fā)現(xiàn)與一項(xiàng)使用氯膦酸鹽脂質(zhì)體ClodronateLiposomes（品牌：LIPOSOMA，貨號：CP-005-005，總代理：靶點(diǎn)科技）介導(dǎo)的肺巨噬細(xì)胞耗竭的較早研究一致和最近的一項(xiàng)研究表明肺中產(chǎn)生載脂蛋白 E、單核細(xì)胞衍生的肺泡巨噬細(xì)胞纖維化消退。這些結(jié)果可能有助于解釋EGR2突變個體發(fā)生限制性肺病的原因。

總之，我們的結(jié)果表明 EGR2 是一種進(jìn)化上保守的肺泡巨噬細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其缺失會導(dǎo)致主要的表型、轉(zhuǎn)錄和功能缺陷。通過將 EGR2 鑒定為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，我們已經(jīng)開始剖析 GM-CSF 和 TGF-β 等常見因素如何在巨噬細(xì)胞分化過程中賦予特異性。我們的工作揭示了不同的分子模塊似乎如何控制肺泡巨噬細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)與免疫保護(hù)功能，這可能通過允許獨(dú)立控制這些功能對宿主有益。鑒于最近使用人體系統(tǒng)的研究表明，人類肺泡巨噬細(xì)胞的維持需要單核細(xì)胞輸入，EGR2 可能在人肺泡巨噬細(xì)胞分化中發(fā)揮特別重要的作用。因此，需要進(jìn)一步的工作來充分了解 EGR2 下游的分子通路，這在小鼠和人類之間是否保守，以及 EGR2 是否在不同的病理環(huán)境中發(fā)揮不同的作用。

參考文獻(xiàn)：原始文獻(xiàn)鏈接science.org/doi/10.1126/sciimmunol.abj2132#。原文標(biāo)題：The transcription factor EGR2 is indispensable for tissue-specific imprinting of alveolar macrophages in health and tissue repair。